V neuroregenerácii je nervový vodič (označovaný aj ako umelý nervový vodič alebo umelý nervový štep, na rozdiel od autotransplantátu) umelý prostriedok na usmernenie axónového rastu na uľahčenie regenerácie nervu a je jedným z viacerých klinických postupov liečby poranení nervov. Ak nie je možné vykonať priame zošitie dvoch pahýľov prerušeného nervu bez napätia, štandardnou klinickou liečbou poranení periférnych nervov je autológny nervový štep. Vzhľadom na obmedzenú dostupnosť darcovského tkaniva a funkčnú obnovu pri autológnom štepení nervov sa výskum v oblasti nervového tkanivového inžinierstva zameral na vývoj bioumelých vodičov nervov ako alternatívnej liečby, najmä pri veľkých defektoch. Podobné techniky sa skúmajú aj na obnovu nervov v mieche, ale regenerácia nervov v centrálnom nervovom systéme predstavuje väčšiu výzvu, pretože jeho axóny sa vo svojom prirodzenom prostredí výrazne neregenerujú.
Vytvorenie umelých kanálov sa nazýva aj entubulácia, pretože nervové zakončenia a medzera sú uzavreté v rúrke zloženej z biologických alebo syntetických materiálov. Bez ohľadu na to, či je konduit vo forme biologickej trubice, syntetickej trubice alebo konduitu vytvoreného tkanivovým inžinierstvom, mal by uľahčovať neurotropnú a neurotrofnú komunikáciu medzi proximálnym a distálnym koncom nervovej medzery, blokovať vonkajšie inhibičné faktory a poskytovať fyzikálne vedenie pre axónový rast. Najzákladnejším cieľom nervového vodiča je kombinovať fyzikálne, chemické a biologické podnety za podmienok, ktoré podporia tvorbu tkaniva.
Materiály, ktoré sa použili na výrobu biologických hadičiek, zahŕňajú krvné cievy a kostrové svaly, zatiaľ čo neabsorbovateľné a bioabsorbovateľné syntetické hadičky boli vyrobené zo silikónu a polyglykolidu. Tkanivové vodiče na vedenie nervov sú kombináciou mnohých prvkov: štruktúry lešenia, materiálu lešenia, bunkových terapií, neurotrofických faktorov a biomimetických materiálov. Výber fyzikálnych, chemických a biologických podnetov, ktoré sa majú použiť, vychádza z vlastností prostredia nervu, ktoré je rozhodujúce pri vytváraní čo najžiadanejšieho prostredia pre regeneráciu axónov. Medzi faktory, ktoré riadia výber materiálu, patrí biokompatibilita, biodegradovateľnosť, mechanická integrita, kontrolovateľnosť počas rastu nervu, implantácia a sterilizácia.
Najzákladnejšou charakteristikou nervového vodiča je jeho trojrozmerná štruktúra alebo topografia lešenia. Topografia lešenia môže ovplyvniť rôzne parametre rastu implantovaných buniek, ako je adhézia buniek, morfológia, životaschopnosť, apoptóza, genetická regulácia a pohyblivosť. V tkanivovom inžinierstve sa za tri hlavné úrovne štruktúry lešenia považujú:
Na simuláciu podmienok tvorby nervového tkaniva in vivo je dôležitá nadstavba vodiča alebo lešenia. Extracelulárna matrica, ktorá je zodpovedná najmä za riadenie rastu a tvorby tkaniva, má komplexnú nadstavbu tvorenú mnohými navzájom prepletenými vláknitými molekulami. Spôsoby vytvárania umelej nadstavby zahŕňajú použitie termoreaktívnych hydrogélov, pozdĺžne orientovaných kanálikov, pozdĺžne orientovaných vlákien, natiahnutých axónov a nanovláknitých lešení.
Termoreaktívne hydrogély
Pri traumatickom poškodení mozgu (TBI) sa spúšťa séria škodlivých udalostí, ktoré vedú k odumieraniu buniek a celkovej dysfunkcii, čo spôsobuje vznik dutiny s nepravidelným tvarom lézie. Vzniknutá dutina spôsobuje tkanivovo-inžinierskym scaffoldom mnohé problémy, pretože je potrebná invazívna implantácia a scaffold sa často neprispôsobí tvaru dutiny. S cieľom obísť tieto ťažkosti boli navrhnuté termoreaktívne hydrogély, ktoré podliehajú prechodom medzi roztokom a gélom (sol-gel), ktoré sú spôsobené rozdielmi medzi izbovou a fyziologickou teplotou, aby sa uľahčila implantácia prostredníctvom gélovania in situ a prispôsobenia sa tvaru dutiny, čo umožňuje ich minimálne invazívne vstrekovanie.
Metylcelulóza (MC) je materiál s dobre definovanými sol-gél prechodmi v optimálnom rozsahu teplôt. Ku gélovaniu MC dochádza v dôsledku nárastu vnútromolekulových a medzimolekulových hydrofóbnych interakcií so zvyšujúcou sa teplotou. Prechod medzi roztokom a gélom sa riadi dolnou kritickou teplotou roztoku (LCST), čo je teplota, pri ktorej sa modul pružnosti rovná modulu viskozity. LCST nesmie prekročiť fyziologickú teplotu (37 °C), ak má scaffold pri implantácii gélovať, čím sa vytvorí minimálne invazívne podanie. Po implantácii do dutiny po TBI lézii alebo do vedenia periférneho nervu MC vyvoláva minimálnu zápalovú reakciu. Pre minimálne invazívne podanie je tiež veľmi dôležité, aby mal roztok MC viskozitu pri teplotách nižších ako jeho LCST, čo umožňuje jeho injekčné podanie cez ihlu s malým priemerom na implantáciu v aplikáciách in vivo. MC sa úspešne používa ako podávacia látka pre intraoptické a perorálne farmaceutické terapie. Medzi nevýhody MC patrí jeho obmedzený sklon k adsorpcii proteínov a adhézii neurónových buniek, čo z neho robí nebiologický hydrogél. Vzhľadom na tieto nevýhody si použitie MC pri regenerácii nervového tkaniva vyžaduje pripojenie biologicky aktívnej skupiny na chrbticu polyméru s cieľom zvýšiť adhéziu buniek.
Ďalším termoreaktívnym gélom je gél, ktorý vzniká kombináciou chitosanu s glycerofosfátovou (GP) soľou. Pri teplotách nad 37 °C dochádza k gelovaniu tohto roztoku. Gelizácia chitosanu/GP je pomerne pomalá, na začiatku trvá pol hodiny a ďalších 9 hodín, kým sa úplne stabilizuje. Pevnosť gélu sa pohybuje od 67 do 1572 Pa v závislosti od koncentrácie chitosanu; spodná hranica tohto rozsahu sa blíži k tuhosti mozgového tkaniva. Chitosan/GP preukázal úspech in vitro, ale na zlepšenie prichytenia nervových buniek je potrebné pridať polylyzín. Polylyzín bol kovalentne viazaný na chitosan, aby sa zabránilo jeho difúzii. Polylyzín bol vybraný pre svoju pozitívnu povahu a vysokú hydrofilnosť, ktorá podporuje rast neuritov. Prežívanie neurónov sa zdvojnásobilo, hoci rast neuritov sa s pridaným polylyzínom nezmenil.
Pozdĺžne orientované kanály
Pozdĺžne orientované kanáliky sú makroskopické štruktúry, ktoré možno pridať do kanála, aby regenerujúce axóny mali dobre definované vedenie pre priamy rast pozdĺž lešenia. V lešení s architektúrou mikrotubulárnych kanálov sa regenerujúce axóny môžu predlžovať cez otvorené pozdĺžne kanály tak, ako by sa za normálnych okolností predlžovali cez endoneurálne trubice periférnych nervov. Kanály navyše zväčšujú povrchovú plochu dostupnú pre kontakt s bunkami. Kanály sa zvyčajne vytvárajú vložením ihly, drôtu alebo roztoku druhého polyméru do polymérneho lešenia; po stabilizácii tvaru hlavného polyméru sa ihla, drôt alebo druhý polymér odstráni, aby sa vytvorili kanály. Zvyčajne sa vytvorí viacero kanálov; lešenie však môže pozostávať len z jedného veľkého kanála, ktorý je jednoducho jednou dutou trubicou.
Wang a kol. vytvorili techniku tvarovania na vytvorenie nervového vodiča s viackanálovou vnútornou matricou a vonkajšou stenou trubice z chitosanu. Vo svojej štúdii z roku 2006 Wang a kol. prevliekli akupunktúrne ihly cez dutú chitosanovú rúrku, kde ich na oboch koncoch držia upevnené záplaty vytvorené pomocou CAD. Do trubice sa potom vstrekne roztok chitosanu, ktorý stuhne a po odstránení ihiel sa vytvoria pozdĺžne orientované kanály. Na charakterizáciu sa potom vytvoril reprezentatívny scaffold s 21 kanálmi pomocou akupunktúrnych ihiel s priemerom 400 µm. Pri skúmaní pod mikroskopom sa zistilo, že kanály sú približne kruhové s miernymi nepravidelnosťami; všetky kanály boli zarovnané s vnútorným priemerom vonkajšej steny trubice. Mikro-CT zobrazením sa potvrdilo, že kanály prechádzajú celou dĺžkou lešenia. Pri absorpcii vody sa vnútorný a vonkajší priemer lešenia zväčšili, ale priemer kanálikov sa výrazne nemenil, čo je potrebné na zachovanie tvaru lešenia, ktorý vedie k predlžovaniu neurónov. Vnútorná štruktúra zabezpečuje zvýšenie pevnosti v tlaku v porovnaní so samotnou dutou trubicou, čo môže zabrániť zrúteniu lešenia na rastúce neurity. Bunky Neuro-2a boli schopné rásť na vnútornej matrici lešenia a orientovali sa pozdĺž kanálikov. Hoci sa táto metóda testovala len na chitosane, dá sa prispôsobiť aj iným materiálom.
lyofilizácia a proces zahrievania drôtom je ďalšou metódou vytvárania pozdĺžne orientovaných kanálov, ktorú vyvinuli Huang et al. (2005). Roztok chitosanu a kyseliny octovej bol zmrazený okolo nikel-medených (Ni-Cu) drôtov v pasci z tekutého dusíka; následne boli drôty zahriate a odstránené. Ni-Cu drôty boli vybrané, pretože majú vysokú úroveň odporu. Na sublimáciu kyseliny octovej sa použili lyofilizátory s riadenou teplotou. Neboli zistené žiadne dôkazy o spájaní alebo rozdeľovaní kanálov. Po lyofilizácii sa rozmery lešenia zmenšili, čo spôsobilo, že kanály boli o niečo menšie ako použitý drôt. Scaffoldy boli neutralizované na fyziologickú hodnotu pH pomocou zásady, čo malo dramatický vplyv na poréznu štruktúru. Slabšie zásady udržiavali poréznu štruktúru rovnomernú, ale silnejšie zásady ju robili nekontrolovateľnou. Tu použitú techniku možno mierne upraviť tak, aby vyhovovala aj iným polymérom a rozpúšťadlám.
Iný spôsob vytvorenia pozdĺžne orientovaných kanálov je vytvoriť potrubie z jedného polyméru s vloženými pozdĺžne orientovanými vláknami z iného polyméru; potom selektívne rozpúšťať vlákna, aby sa vytvorili pozdĺžne orientované kanály. Polykaprolaktónové (PCL) vlákna boli vložené do (hydroxyetyl)metakrylátového (HEMA) lešenia. PCL bol vybraný namiesto poly(kyseliny mliečnej) (PLA) a poly(kyseliny mliečno-ko-glykolovej) (PLGA), pretože je nerozpustný v HEMA, ale rozpustný v acetóne. Je to dôležité, pretože HEMA sa použila na hlavný materiál vedenia a acetón sa použil na selektívne rozpúšťanie polymérnych vlákien. Extrudované PCL vlákna sa vložili do sklenenej trubice a vstrekol sa roztok HEMA. Počet vytvorených kanálikov bol konzistentný od dávky k dávke a odchýlky v priemere vlákien sa mohli znížiť vytvorením lepšie kontrolovaného systému vytláčania PCL vlákien. Skúmaním zmien pórovitosti sa potvrdilo, že vytvorené kanály sú kontinuálne a homogénne. Tento proces je bezpečný, reprodukovateľný a má kontrolovateľné rozmery. V podobnej štúdii, ktorú uskutočnili Yu a Shoichet (2005), sa HEMA kopolymerizovala s AEMA s cieľom vytvoriť gél P(HEMA-co-AMEA). Do gélu boli vložené polykaprolaktónové (PCL) vlákna, ktoré sa potom selektívne rozpúšťali acetónom so sonikáciou, aby sa vytvorili kanály. Zistilo sa, že HEMA v zmesi s 1 % AEMA vytvára najsilnejšie gély. V porovnaní so scaffoldmi bez kanálikov môže pridanie 82 – 132 kanálikov zabezpečiť približne 6 – 9-násobné zväčšenie plochy povrchu, čo môže byť výhodné pre regeneračné štúdie, ktoré závisia od kontaktných podnetov.
Itoh a kol. (2003) vyvinuli lešenie pozostávajúce z jedného veľkého pozdĺžne orientovaného kanála, ktoré bolo vytvorené pomocou chitosanových šliach z krabov. Šľachy boli odobraté z krabov (Macrocheira kaempferi) a opakovane premyté roztokom hydroxidu sodného na odstránenie proteínov a deacetyláciu šľachového chitínu, ktorý sa následne stal známy ako šľachový chitosan. Do dutej šľachovej chitosanovej trubice kruhového prierezu (priemer: 2 mm; dĺžka: 15 mm) sa vložila tyč z nehrdzavejúcej ocele s trojuholníkovým prierezom (každá strana dlhá 2,1 mm). Pri porovnaní rúrok kruhového a trojuholníkového tvaru sa zistilo, že trojuholníkové rúrky majú lepšiu mechanickú pevnosť, lepšie držia tvar a zväčšujú dostupnú plochu. Hoci ide o účinnú metódu na vytvorenie jedného kanála, neposkytuje takú veľkú plochu pre rast buniek ako viackanálové lešenia.
Pozdĺžne orientované vlákna
Okrem pozdĺžne orientovaných kanálov možno do kanála pridať aj pozdĺžne orientované vlákna, ktoré regenerujúcim axónom poskytnú usmernenie pre pozdĺžne orientovaný rast. Štúdie, ktoré uskutočnili Newman et al. (2006) a Cai et al. (2005), ukázali, že pridanie vlákien do lešenia podporuje vnútorné kontaktné vedenie a zvyšuje priepustnosť pre lepšiu výmenu živín a odpadov, takže lešenie má lepšiu výkonnosť pri regenerácii nervov ako nepriepustné kanáliky, v ktorých chýbajú vlákna.
Newman et al. (2006) vložili vodivé a nevodivé vlákna do kolagénového lešenia-TERP (kolagén zosieťovaný terpolymérom poly(N-izopropylakrylamidu) (PNiPAAm) ). Vlákna sa vložili tak, že sa pevne zavinuli na malé sklenené sklíčko a medzi ne a ďalšie sklíčko sa vložil roztok kolagénu-TERP; dištančné prvky medzi sklíčkami nastavili hrúbku gélu na 800 µm. Vodivé vlákna boli uhlíkové vlákna a kevlar a nevodivé vlákna boli nylon-6 a volfrámový drôt. Na uhlíkovom vlákne sa neurity rozprestierajú vo všetkých smeroch v hrubých zväzkoch; pri ostatných troch vláknach sa však neurity rozprestierali v jemných pavučinových konformáciách. Na uhlíkových a kevlarových vláknach neurity nevykazovali žiadny smer rastu, ale rástli pozdĺž nylonových vlákien 6 a do určitej miery pozdĺž volfrámového drôtu. Na lešení z volfrámového drôtu a nylonových vlákien 6 neurity okrem rastu pozdĺž povrchu rástli aj do gélu v blízkosti rozhrania medzi vláknami a gélom. Všetky gély s vláknami okrem kevlarových vykazovali výrazný nárast predĺženia neuritov v porovnaní s gélmi bez vlákien. Medzi nevodivými a vodivými vláknami nebol rozdiel v predĺžení neuritov.
Cai a kol. vo svojej štúdii z roku 2005 pridali do dutých poly(mliečnych) (PLA) a kremíkových trubíc poly(L-mliečne) (PLLA) mikrovlákna. Charakteristiky vedenia mikrovlákien boli nepriamo úmerné priemeru vlákna, pričom menšie priemery podporovali lepšiu pozdĺžne orientovanú migráciu buniek a axonálnu regeneráciu. Mikrovlákna tiež podporovali myelinizáciu počas obnovy periférnych nervov.
Ukázalo sa, že pri mechanickom natiahnutí v centrálnej časti axónového valca dochádza k rastu zrelých axónových dráh. Takéto mechanické natiahnutie sa aplikovalo pomocou vlastného bioreaktora na rast axónov, ktorý pozostával zo štyroch hlavných komponentov: špeciálne navrhnutá expanzná komora na axóny, lineárny pohybový stôl, krokový motor a riadiaca jednotka. Kultúra nervového tkaniva je umiestnená v expanznej komore s portom na výmenu plynov a odnímateľným naťahovacím rámom, ktorý dokáže oddeliť dve skupiny somov (tiel neurónových buniek), a tak natiahnuť ich axóny. Na podporu rastu väčších natiahnutých axónových dráh, ktoré boli viditeľné voľným okom, sa použil kolagénový gél. Existujú dve príčiny zvýšenia rastu vďaka kolagénovému povlaku: Po zaschnutí kolagénu sa kultúra stala hydrofóbnou, čo umožnilo rast hustejšej koncentrácie neurónov, a 2) kolagénový povlak vytvoril nerušený povlak cez dva predlžovacie substráty. Pri skúmaní pomocou skenovacieho elektrónového mikroskopu a TEM sa nepreukázali žiadne známky stenčenia axónov v dôsledku natiahnutia a cytoskelet sa zdal byť normálny a neporušený. Axónové dráhy vypestované natiahnutím sa kultivovali na biokompatibilnej membráne, ktorá sa dala priamo sformovať do valcovej štruktúry na transplantáciu, čím sa odstránila potreba prenášať axóny na lešenie po ukončení rastu. Axóny vypestované v strečových dráhach boli schopné rásť bezprecedentnou rýchlosťou 1 cm/deň už po 8 dňoch aklimatizácie, čo je oveľa viac ako maximálna rýchlosť rastu 1 mm/deň, ktorá sa meria pri predlžovaní rastového kužeľa. Rýchlosť 1 mm/deň je zároveň priemernou rýchlosťou transportu štrukturálnych prvkov, ako sú neurofilamentá.
Výskum nanorozmerných vlákien sa snaží napodobniť štruktúru kolagénu v extracelulárnej matrici vytvorením vlákien, ktoré sa približujú nanorozmernému priemeru prírodných kolagénových zväzkov. Tri odlišné metódy tvorby nanovláknových lešení sú samoskladanie, separácia fáz a elektrospinning. Existuje však mnoho ďalších metód na tvorbu nanovláknitých lešení.
K samoskladaniu nanovláknových lešení môže dôjsť len vtedy, ak sú samotné vlákna navrhnuté na samoskladanie. Jedným z bežných spôsobov, ako riadiť samousporiadanie lešenia vlákien, je použitie amfifilných peptidov, takže vo vode riadi samousporiadanie hydrofóbna časť. Starostlivo vypočítané inžinierstvo amfifilných peptidov umožňuje presnú kontrolu nad samousporiadanou matricou. Samousporiadanie dokáže vytvoriť usporiadané aj neusporiadané topografie. Phillips et al. (2005) vyvinuli a in vitro a in vivo testovali samousporiadanú kolagén- Schwannovu bunkovú matricu, ktorá umožnila in vitro zarovnanie predĺženia DRG neuritov. Kolagénové gély sa vo veľkej miere používajú ako substráty pre trojrozmerné tkanivové kultúry. Bunky sú schopné vytvárať integrínom sprostredkované väzby s kolagénom, čo iniciuje zostavenie cytoskeletu a pohyblivosť buniek. Keď sa bunky pohybujú pozdĺž kolagénových vlákien, vytvárajú sily, ktoré gél sťahujú. Keď sú kolagénové vlákna zviazané na oboch koncoch, sily generované bunkami vytvárajú jednoosové napätie, ktoré spôsobuje vyrovnanie buniek a kolagénových vlákien. Výhodou tejto matrice je jej jednoduchosť a rýchlosť prípravy. Rozpustný plazmatický fibronektín sa môže tiež sám zostaviť do stabilných nerozpustných vlákien, keď sa vo viskóznom roztoku vystaví priamemu mechanickému strihu. Phillips a i. (2004) skúmali novú metódu agregácie strihom, ktorá spôsobuje lepšiu agregáciu. Mechanické strihanie sa vytvorilo pretiahnutím 0,2 ml bolusu do vzdialenosti 3 cm pomocou klieští; fibronektín sa agregoval do nerozpustných vlákien na rýchlo sa pohybujúcom rozhraní v ultrafiltračnej bunke. Navrhovaným mechanizmom tejto agregácie vlákien je predlžovanie a rozťahovanie proteínov pod mechanickou strihovou silou, čo vedie k bočnému baleniu a agregácii proteínových vlákien. Phillips a kol. ukázali, že mechanický strih vyvolaný natiahnutím fibronektínového gélu s vysokou viskozitou spôsobuje podstatné zmeny v jeho štruktúre a že pri aplikácii jednoosového natiahnutia viskózny fibronektínový gél vytvára orientované vláknité agregáty fibronektínu; vláknité agregáty majú navyše zníženú rozpustnosť a môžu podporovať rôzne typy buniek in vitro.
Separácia fáz umožňuje vytvárať trojrozmerné submikrometrové vláknové lešenia bez použitia špecializovaného zariadenia. Päť krokov zapojených do separácie fáz je rozpúšťanie polyméru, separácia fáz a gélovanie, extrakcia rozpúšťadla z gélu, zmrazenie a lyofilizácia vo vode. Konečným produktom je súvislá sieť vlákien. Fázovú separáciu možno upraviť tak, aby vyhovovala mnohým rôznym aplikáciám, a štruktúru pórov možno meniť použitím rôznych rozpúšťadiel, čím sa celý proces môže zmeniť z kvapalina-kvapalina na pevná látka-kvapalina. Pórovitosť a priemer vlákien možno tiež upraviť zmenou počiatočnej koncentrácie polyméru; vyššia počiatočná koncentrácia vedie k menšiemu počtu pórov a väčšiemu priemeru vlákien. Táto technika sa môže použiť na vytvorenie sietí vlákien s priemerom dosahujúcim priemer vlákien kolagénu typu I. Vytvorená sieť vlákien je náhodne orientovaná a doteraz nebola vykonaná práca, ktorá by sa pokúsila vlákna usporiadať. Fázová separácia je široko používaná technika na jednoduché vytváranie vysoko poréznych nanovláknitých lešení.
Elektrotáčanie vytvára nanovlákna elektrickým nabitím kvapky polymérnej taveniny alebo roztoku a jej zavesením z kapiláry. Potom sa na jeden koniec kapiláry aplikuje elektrické pole, kým náboj neprekročí povrchové napätie, čím sa vytvorí prúd polyméru, ktorý sa predlžuje a stenčuje. Elektricky nabité polyméry zostávajú, keď sa rozpúšťadlo z prúdu odparí, a zhromažďujú sa na uzemnenom povrchu. Boli natočené vlákna s priemerom od menej ako 3 nm do viac ako 1 µm. Proces je ovplyvnený parametrami systému, ako je molekulová hmotnosť polyméru a vlastnosti roztoku, a parametrami procesu, ako je rýchlosť prietoku, vzdialenosť medzi kolektorom a kapilárou a pohyb kolektora. Elektrotáčanie vytvára vlákna s kontrolovateľným priemerom a usporiadaním. Vytvorená sieť vlákien je neusporiadaná a obsahuje vysoký pomer povrchu k objemu v dôsledku vysokej pórovitosti; veľký povrch siete je ideálny na rast a transport odpadových látok a živín v inžinierstve nervových tkanív. Dve vlastnosti elektrospunovaných scaffoldov, ktoré sú výhodné pre inžinierstvo neurónového tkaniva, sú morfológia a architektúra, ktorá presne napodobňuje ECM, a póry, ktoré majú správny rozsah veľkostí, ktorý umožňuje výmenu živín, ale zabraňuje rastu gliového tkaniva jazvy (približne 10 µm). Ukázalo sa, že náhodné elektrospunované PLLA scaffoldy majú zvýšenú adhéziu buniek, čo môže byť spôsobené zvýšenou drsnosťou povrchu. Siete elektrospunovaných vlákien sa dajú tiež usporiadať a použiť na prezentáciu pokynov na zarovnanie buniek; to je výhodné, pretože trojrozmerné zarovnané lešenia veľkého rozsahu sa nedajú ľahko vytvoriť pomocou makrofabrikačných techník. V štúdii, ktorú uskutočnili Yang a kol. (2005), boli vytvorené, charakterizované a porovnané zarovnané a náhodné elektrospunované mikrovláknové a nanovláknové lešenia z poly(L- mliečnej kyseliny) (PLLA). Priemery vlákien boli priamo úmerné počiatočnej koncentrácii polyméru použitého na elektrotvorbu; priemerný priemer zarovnaných vlákien bol menší ako priemer náhodných vlákien pri rovnakých podmienkach spracovania. Ukázalo sa, že nervové kmeňové bunky sa predlžovali paralelne so zarovnanými elektrospunovými vláknami. Vyrovnané nanovlákna mali väčšiu priemernú dĺžku neuritu v porovnaní s vyrovnanými mikrovláknami, náhodnými mikrovláknami a náhodnými nanovláknami. Okrem toho sa na zarovnaných nanovláknach diferencovalo viac buniek ako na zarovnaných mikrovláknach. Zarovnané nanovlákna sú teda na podporu regenerácie nervov výhodnejšie ako nezarovnané vlákna a mikrovlákna.
Mikroštruktúra a nanoštruktúra
Mikroštruktúra a nanoštruktúra spolu s nadstavbou sú tri hlavné úrovne štruktúry lešenia, ktoré si zaslúžia pozornosť pri vytváraní topografie lešenia. Zatiaľ čo superštruktúra sa vzťahuje na celkový tvar lešenia, mikroštruktúra sa vzťahuje na štruktúru povrchu na bunkovej úrovni a nanoštruktúra sa vzťahuje na štruktúru povrchu na subcelulárnej úrovni. Mikroštruktúra a nanoštruktúra sú hlavným predmetom záujmu nedávneho výskumu, ale ešte stále neexistuje veľa zavedených metód na modifikáciu štruktúry v nanorozmeroch. V poslednom čase došlo k zmene záujmu z mikrorozmerov na nanorozmery, čo je motivované početnými nanoštruktúrami ECM. Na usmernenie rastu buniek možno použiť chemické aj fyzikálne podnety.
Fyzikálne náznaky sa vytvárajú vytvorením usporiadanej povrchovej štruktúry na úrovni mikroštruktúry a nanoštruktúry. Ukázalo sa, že samotné fyzikálne náznaky majú významný vplyv na bunkovú organizáciu v kultúre; táto vlastnosť fyzikálneho vedenia je známa ako kontaktné vedenie. Existuje množstvo metód na vytváranie fyzikálnych topografií; možno ich rozdeliť na tie, ktoré vytvárajú usporiadané topografie, a tie, ktoré vytvárajú neusporiadané topografie.
Usporiadané topografie sú definované ako vzory, ktoré sú usporiadané a geometricky presné. Hoci existuje mnoho metód na vytváranie usporiadaných topografií, zvyčajne sú časovo náročné, vyžadujú si zručnosť, skúsenosti a použitie drahého zariadenia.
Pri litografii elektrónovým lúčom (EBL) sa rezist citlivý na elektróny vystaví lúču vysokoenergetických elektrónov. Na výber je pozitívny alebo negatívny typ rezistu; pri negatívnych rezistoch sa však môže dosiahnuť nižšie rozlíšenie prvkov. Vzory sa vytvárajú naprogramovaním presnej dráhy zväzku elektrónov pozdĺž povrchu materiálu. Rozlíšenie je ovplyvnené ďalšími faktormi, ako je rozptyl elektrónov v reziste a spätný rozptyl od substrátu. EBL dokáže vytvoriť jednotlivé povrchové prvky s veľkosťou rádovo 3 – 5 nm. Ak sa vyžaduje viacero prvkov na veľkej ploche povrchu, ako je to v prípade tkanivového inžinierstva, rozlíšenie klesá a prvky sa dajú vytvoriť len do veľkosti 30 – 40 nm a vývoj rezistu začína mať väčšiu váhu na tvorbu vzoru. Na zabránenie rozpúšťaniu rezistu sa môže použiť ultrazvukové miešanie na prekonanie medzimolekulárnych síl. Okrem toho izopropylalkohol (IPA) pomáha vytvárať polia s vysokou hustotou. EBL sa môže stať rýchlejším a menej nákladným procesom replikovaním nanometrových vzorov v polymérnych materiáloch; proces replikácie bol demonštrovaný s polykaprolaktónom (PCL) pomocou lisovania za tepla a liatia do rozpúšťadla. V štúdii, ktorú uskutočnili Gomez a i. (2007), sa ukázalo, že mikrokanály široké 1 a 2 µm a hlboké 400 a 800 nm vytvorené metódou EBL na PDMS zvyšujú tvorbu axónov hipokampálnych buniek v kultúre viac ako imobilizované chemické podnety.
Röntgenová litografia je ďalšou metódou na vytváranie usporiadaných vzorov, ktoré možno použiť na skúmanie úlohy, ktorú topografia zohráva pri podpore neuritogenézy. Parametre masky určujú periodicitu vzoru, ale šírka a hĺbka hrebeňa sú určené podmienkami leptania. V štúdii boli vytvorené hrebene s periódou od 400 do 4 000 nm, šírkou od 70 do 1900 nm a hĺbkou drážky 600 nm; vyvíjajúce sa neurity vykazovali kontaktné vedenie s prvkami malými ako 70 nm a viac ako 90 % neuritov bolo v rámci 10 stupňov paralelne zarovnaných s hrebienkami a drážkami. Nebol zaznamenaný významný rozdiel v orientácii vzhľadom na použité veľkosti prvkov. Počet neuritov na bunku bol obmedzený hrebeňmi a drážkami, čím sa vytvorili skôr bipolárne ako rozvetvené fenotypy.
Neusporiadané topografie sú vo všeobecnosti vytvorené procesmi, ktoré sa vyskytujú spontánne počas iného spracovania; vzory majú náhodnú orientáciu a organizáciu s nepresnou alebo žiadnou kontrolou geometrie prvkov. Výhodou vytvárania neusporiadaných topografií oproti usporiadaným je, že procesy sú často menej časovo náročné, menej nákladné a nevyžadujú si veľké zručnosti a skúsenosti. Neusporiadané topografie možno vytvoriť demixovaním polymérov, koloidnou litografiou a chemickým leptaním.
Pri demixovaní polymérov dochádza k spontánnemu oddeleniu fáz v polymérnych zmesiach; často sa vyskytuje počas podmienok, ako je napríklad odlievanie na kremíkové doštičky. Medzi prvky, ktoré možno touto metódou vytvoriť, patria nanorozmerné jamky, ostrovčeky a stužky, ktoré možno do určitej miery kontrolovať úpravou pomeru a koncentrácie polymérov s cieľom zmeniť tvar a veľkosť prvkov. V horizontálnom smere sa nedá príliš kontrolovať, hoci vertikálny smer prvkov sa dá presne riadiť. Keďže vzor je v horizontálnom smere veľmi neusporiadaný, táto metóda sa môže použiť len na štúdium interakcií buniek s nanotopografiami s určitou výškou.
Koloidná litografia je lacná a dá sa použiť na vytvorenie povrchov s kontrolovanou výškou a priemerom. Nanokoloidy sa používajú ako leptacia maska tak, že sa rozprestrú po povrchu materiálu a potom sa bombardovanie iónovým lúčom alebo odparovanie filmu použije na leptanie okolo nanokoloidov, čím sa vytvoria nanoslúpiky, resp. nanodiery. Konečnú štruktúru povrchu možno kontrolovať zmenou plochy pokrytej koloidmi a veľkosti koloidov. Plochu pokrytú koloidmi možno meniť zmenou iónovej sily roztoku koloidov. Táto technika dokáže vytvoriť veľké vzorované povrchové plochy, ktoré sú potrebné pre aplikácie tkanivového inžinierstva.
Chemické leptanie zahŕňa namáčanie povrchu materiálu v leptadle, ako je kyselina fluorovodíková (HF) alebo hydroxid sodný (NaOH), až kým sa povrch nevyleptá na požadovanú drsnosť, ktorá sa vytvára pomocou jamiek a výstupkov v nanometrovej škále. Dlhší čas leptania vedie k drsnejším povrchom (t. j. menším jamkám a výstupkom na povrchu). Štruktúry so špecifickou geometriou alebo organizáciou sa touto základnou metódou nedajú vytvoriť, pretože ju možno v najlepšom prípade považovať za povrchovú úpravu na zmenu drsnosti povrchu. Významnou výhodou tejto metódy je jednoduché použitie a nízke náklady na vytvorenie povrchu s nanotopografiami. Kremíkové doštičky boli leptané pomocou HF a ukázalo sa, že priľnavosť buniek sa zvýšila len v určitom rozsahu drsnosti (20 – 50 nm).
Okrem vytvárania topografie pomocou fyzikálnych podnetov ju možno vytvoriť aj pomocou chemických podnetov selektívnym nanesením roztoku polyméru vo forme vzorov na povrch substrátu. Na nanášanie chemických podnetov existujú rôzne metódy. Dve metódy na nanášanie chemických roztokov zahŕňajú vzorkovanie pruhov a piezoelektrické mikrodávkovanie.
Polymérové filmy so vzorom pruhov sa môžu vytvárať na pevných substrátoch odlievaním zriedeného roztoku polyméru. Táto metóda je relatívne jednoduchá, lacná a nemá žiadne obmedzenia týkajúce sa materiálov, ktoré sa môžu použiť. Postup zahŕňa horizontálne prekrývanie sklenených dosiek, pričom sú vertikálne oddelené úzkou medzerou vyplnenou roztokom polyméru. Horná doska sa pohybuje konštantnou rýchlosťou 60 až 100 µm/s. Na okraji posuvného skla sa po odparení rozpúšťadla nepretržite vytvára tenký tekutý film roztoku. Pruhové vzory pripravené pri rýchlostiach 60, 70 a 100 µm/s vytvorili šírku a rozstupy drážok 2,2 a 6,1 µm, 3,6 a 8,4 µm, resp. 4,3 a 12,7 µm; rozsah výšok hrebienkov bol 50 – 100 nm. Tsuruma, Tanaka a kol. dokázali, že embryonálne neurónové bunky kultivované na fólii potiahnutej poly-L-lyzínom sa prichytili a predĺžili rovnobežne s pruhmi poly(ε-kaprolaktónu)/roztoku chloroformu (1 g/l) s úzkou šírkou vzoru a rozstupmi (šírka: 2,2 µm, rozstup: 6,1 µm). Neuróny však rástli naprieč osou vzorov so širokou šírkou a rozstupom (šírka: 4,3 µm, rozstup: 12,7 µm). V priemere mali neuróny na fóliách so vzorom pruhov menej neuritov na bunku a dlhšie neurity v porovnaní s neurónmi na fóliách bez vzoru. Parametre pruhového vzoru teda dokážu určiť smer rastu, dĺžku neuritov a počet neuritov na bunku.
Mikrodispečing sa použil na vytvorenie mikrotvaroviek na polystyrénových kultivačných miskách dávkovaním kvapiek adhezívneho laminínu a neadhezívneho roztoku hovädzieho sérového albumínu (BSA). Mikrodávkovač je piezoelektrický prvok pripojený k tlačidlu na hornej časti kanála vyleptaného v kremíku, ktorý má na každom konci jeden vstup a uprostred dýzu. Piezoelektrický prvok sa po privedení napätia rozťahuje, čo spôsobuje dávkovanie kvapaliny cez dýzu. Mikrodávkovač sa pohybuje pomocou počítačom riadeného x-y stola. Rozlíšenie mikrotrysky závisí od mnohých faktorov: viskozity dávkovanej kvapaliny, rozstupu kvapiek (vzdialenosť medzi stredmi dvoch susedných kvapiek v rade alebo sústave) a substrátu. So zvyšujúcou sa viskozitou sa čiary stenčujú, ale ak je viskozita kvapaliny príliš vysoká, kvapalina sa nedá vytlačiť. Zahrievaním roztoku sa vytvárajú rovnomernejšie proteínové línie. Hoci na vytvorenie súvislých línií je potrebné určité prekrývanie kvapiek, nerovnomerné odparovanie môže spôsobiť nerovnomernú koncentráciu bielkovín pozdĺž línií; tomu možno zabrániť plynulejším odparovaním úpravou vlastností dávkovaného roztoku.
Pri vzorkách obsahujúcich 0,5 mg/ml laminínu rástol vyšší podiel neurónov na mikrodisponovaných líniách ako medzi líniami. Pri vzorkách s 10 mg/ml a 1 mg/ml proteínu BSA a vzorkách s proteínom BSA bez mastných kyselín sa značný počet neuritov vyhýbal proteínovým líniám a rástol medzi líniami. Línie obsahujúce BSA s mastnými kyselinami boli teda pre rast neuritov rovnako nepermisívne ako línie obsahujúce BSA s mastnými kyselinami. Keďže mikrodispozícia nevyžaduje priamy kontakt s povrchmi substrátu, táto technika môže využiť povrchy s jemnou mikro- alebo nanotopológiou, ktoré by sa kontaktom mohli zničiť. Je možné meniť množstvo naneseného proteínu dávkovaním väčšieho alebo menšieho množstva kvapiek. Výhodou mikrodávkovania je, že vzory sa dajú vytvoriť rýchlo za 5 až 10 minút. Keďže piezoelektrický mikrodávkovač si nevyžaduje zahrievanie, je možné dávkovať proteíny a tekutiny citlivé na teplo, ako aj živé bunky.
Výber materiálu lešenia je azda najdôležitejším rozhodnutím, ktoré treba urobiť. Musí byť biokompatibilný a biologicky odbúrateľný; okrem toho musí byť schopný zabudovať akékoľvek požadované fyzikálne, chemické alebo biologické prvky, čo v prípade niektorých chemických prvkov znamená, že musí mať k dispozícii miesto na chemické spojenie peptidov a iných molekúl. Materiály lešenia zvolené pre nervové vodiče sú takmer vždy hydrogély. Hydrogél môže byť zložený z biologických alebo syntetických polymérov. Biologické aj syntetické polyméry majú svoje silné aj slabé stránky. Je dôležité poznamenať, že materiál vodiča môže spôsobiť neadekvátnu regeneráciu, keď (1) rýchlosť degradácie a resorpcie nezodpovedá rýchlosti tvorby tkaniva, (2) napäťovo-deformačné vlastnosti sa nedajú dobre porovnať s vlastnosťami nervového tkaniva, (3) keď dôjde k degradačnému opuchu, ktorý spôsobí výraznú deformáciu, (4) vyvolá sa veľká zápalová reakcia alebo (5) materiál má nízku priepustnosť.
Hydrogély sú triedou biomateriálov, ktoré sú chemicky alebo fyzikálne zosieťované vo vode rozpustné polyméry. Môžu byť buď degradovateľné, alebo nedegradovateľné, čo závisí od ich chemického zloženia, ale vždy, keď je to možné, je vhodnejšie, aby boli degradovateľné. O hydrogély na účely tkanivového inžinierstva je veľký záujem, pretože vo všeobecnosti majú vysokú biokompatibilitu, mechanické vlastnosti podobné mäkkým tkanivám a schopnosť vstrekovať sa ako kvapalina, ktorá želíruje. Keď sú hydrogély fyzikálne zosieťované, musia sa pri gélovaní spoliehať na oddelenie fáz; oddelenie fáz závisí od teploty a je reverzibilné. Niektoré ďalšie výhody hydrogélov sú, že používajú len netoxické vodné rozpúšťadlá, umožňujú infúziu živín a odchod odpadových produktov a umožňujú spontánne zostavovanie buniek. Hydrogély majú nízke medzifázové napätie, čo znamená, že bunky môžu ľahko migrovať cez hranicu medzi tkanivom a implantátom. Pri hydrogéloch je však ťažké vytvoriť širokú škálu mechanických vlastností alebo štruktúr s kontrolovanou veľkosťou pórov.
Syntetický polymér môže byť nerozložiteľný alebo rozložiteľný. Na účely nervového tkanivového inžinierstva sa uprednostňujú degradovateľné materiály vždy, keď je to možné, pretože dlhodobé účinky, ako napríklad zápal a jazva, by mohli vážne poškodiť funkciu nervu. Rýchlosť degradácie závisí od molekulovej hmotnosti polyméru, jeho kryštalinity a pomeru podjednotiek kyseliny glykolovej a kyseliny mliečnej. Kvôli metylovej skupine je kyselina mliečna hydrofóbnejšia ako kyselina glykolová, čo spôsobuje, že jej hydrolýza je pomalšia. Syntetické polyméry majú jemnejšie mechanické vlastnosti a rýchlosť degradácie, ktorú možno kontrolovať v širokom rozsahu, a eliminujú obavy z imunogénnosti. V súčasnosti sa v nervovom tkanivovom inžinierstve používa mnoho rôznych syntetických polymérov. Medzi nevýhody mnohých z týchto polymérov však patrí nedostatočná biokompatibilita a bioaktivita, čo týmto polymérom bráni podporovať prichytenie, proliferáciu a diferenciáciu buniek. Syntetické konduity boli klinicky úspešné len pri oprave veľmi krátkych medzier v nervových léziách menších ako 1 – 2 cm. Okrem toho regenerácia nervov pomocou týchto konduitov ešte nedosiahla úroveň funkčnej obnovy pozorovanej pri autotransplantátoch nervov.
Skupina poly(mliečno-koglykolovej kyseliny)
Medzi polyméry zo skupiny PLGA patria poly (kyselina mliečna) (PLA), poly (kyselina glykolová) (PGA) a ich kopolymér poly (kyselina mliečna-ko-glykolová) (PLGA). Všetky tri polyméry boli schválené Úradom pre kontrolu potravín a liečiv na použitie v rôznych pomôckach. Tieto polyméry sú krehké a nemajú oblasti pre prípustnú chemickú modifikáciu; okrem toho sa rozkladajú skôr objemovo ako povrchovo, čo nie je hladký a ideálny proces rozkladu. V snahe prekonať nedostatok funkcií boli do ich štruktúr začlenené voľné amíny, z ktorých sa môžu naviazať peptidy na riadenie pripojenia a správania buniek.
Metakrylovaný dextrán (Dex-MA) kopolymerizovaný s aminoetylmetakrylátom (AEMA)
Dextrán je polysacharid pochádzajúci z baktérií; zvyčajne sa vyrába pomocou enzýmov z určitých kmeňov leukonostokov alebo streptokokov. Pozostáva z α-1,6-viazaných D-glukopyranózových zvyškov. Sieťované hydrogélové guľôčky dextránu sa široko používajú ako matrice s nízkou väzbou bielkovín pre aplikácie v stĺpcovej chromatografii a pre technológiu bunkových kultúr s mikronosičmi. Až donedávna sa však dextránové hydrogély skúmali v biomateriálových aplikáciách a konkrétne ako nosiče liečiv. Medzi výhody použitia dextránu v biomateriálových aplikáciách patrí jeho odolnosť voči adsorpcii proteínov a priľnavosti buniek, čo umožňuje určovať špecifickú priľnavosť buniek pomocou zámerne pripojených peptidov zo zložiek ECM. AEMA bola kopolymerizovaná s Dex-MA s cieľom zaviesť primárne aminové skupiny, ktoré poskytnú miesto na pripojenie peptidov odvodených z ECM na podporu adhézie buniek. Peptidy možno imobilizovať pomocou sulfo-SMMC spojovacej chémie a peptidov zakončených cysteínom. Kopolymerizácia Dex-MA s AEMA umožnila okrem podpory bunkových interakcií zachovať makroporéznu geometriu lešení.
Poly(glycerol sebakát) (PGS)
Z poly(glycerol sebakátu) (PGS) bol vyvinutý nový biologicky odbúrateľný, húževnatý elastomér na použitie pri vytváraní nervového vodiča. PGS bol pôvodne vyvinutý na účely inžinierstva mäkkých tkanív, aby špecificky napodobňoval mechanické vlastnosti ECM. Považuje sa za elastomér, pretože je schopný zotaviť sa z deformácie v mechanicky dynamickom prostredí a účinne rovnomerne rozložiť napätie v regenerujúcich sa tkanivách vo forme mikrostresov. PGS sa syntetizuje polykondenzačnou reakciou glycerolu a kyseliny sebakovej, ktorá sa môže spracovať taveninou alebo rozpúšťadlom do požadovaného tvaru. PGS má Youngov modul 0,28 MPa a pevnosť v ťahu vyššiu ako 0,5 MPa. Periférny nerv má Youngov modul približne 0,45 MPa, ktorý je veľmi blízky modulu PGS. Okrem toho pri PGS dochádza k degradácii povrchu, ktorú sprevádzajú straty lineárnej hmotnosti a pevnosti počas resorpcie. Po implantácii sa stanovil polčas degradácie na 21 dní; úplná degradácia nastala na 60. deň. Pri degradácii PGS dochádza k minimálnej absorpcii vody a nedochádza k zistiteľnému napučaniu; napučanie môže spôsobiť deformáciu, ktorá zužuje tubulárny lúmen a môže brániť regenerácii. Je výhodné, že čas degradácie PGS sa dá meniť zmenou stupňa zosieťovania a pomeru kyseliny sebakovej a glycerolu. V štúdii Sundbacka et al. (2005) mali implantované PGS a PLGA kanáliky podobné skoré reakcie tkaniva; zápalové reakcie PLGA však neskôr prudko stúpli, zatiaľ čo zápalové reakcie PGS naďalej klesali.
Polyetylénglykolový hydrogél
Polyetylénglykolové (PEG) hydrogély sú biokompatibilné a preukázateľne tolerované v mnohých typoch tkanív vrátane CNS. Mahoney a Anseth vytvorili PEG hydrogély fotopolymerizáciou metakrylátových skupín kovalentne spojených s degradovateľnými PEG makromérmi. Degradácia hydrogélov sa sledovala v priebehu času meraním mechanickej pevnosti (modul pevnosti v tlaku) a priemernej veľkosti oka z údajov o pomere napúčania. Spočiatku boli polymérne reťazce silne zosieťované, ale s postupujúcou degradáciou sa esterové väzby hydrolyzovali, čo umožnilo gélu napučať; modul pružnosti v tlaku sa znižoval s rastúcou veľkosťou oka, až kým sa hydrogél úplne nerozpustil. Ukázalo sa, že neurónové prekurzorové bunky bolo možné fotokapsulovať a kultivovať na PEG géloch s minimálnym úhynom buniek. Keďže veľkosť oka je spočiatku malá, hydrogél blokuje zápalové a iné inhibičné signály z okolitého tkaniva. Keď sa veľkosť oka zväčší, hydrogél je schopný slúžiť ako lešenie na regeneráciu axónov.
Používanie biologických polymérov má oproti syntetickým polymérom svoje výhody. Je veľmi pravdepodobné, že budú mať dobrú biokompatibilitu a budú ľahko degradovateľné, pretože sa v určitej forme už nachádzajú v prírode. Existuje však aj niekoľko nevýhod. Majú ťažkopádne mechanické vlastnosti a rýchlosť degradácie, ktorú nemožno kontrolovať v širokom rozsahu. Okrem toho vždy existuje možnosť, že materiály prírodného pôvodu môžu spôsobiť imunitnú reakciu alebo obsahovať mikróby. Pri výrobe materiálov prírodného pôvodu bude tiež dochádzať k odchýlkam medzi jednotlivými šaržami pri rozsiahlych postupoch izolácie, ktoré sa nedajú kontrolovať. Medzi ďalšie problémy, ktoré trápia prírodné polyméry, patrí ich neschopnosť podporovať rast cez dlhé medzery medzi léziami z dôvodu možnosti kolapsu, tvorby jaziev a skorého opätovného vstrebávania. Napriek všetkým týmto nevýhodám, z ktorých niektoré sa dajú prekonať, sa biologické polyméry v mnohých situáciách stále ukazujú ako optimálna voľba.
Kyselina polysialová (PSA) je relatívne nový biokompatibilný a bioresorbovateľný materiál na umelé nervové vedenia. Je to homopolymér zvyškov kyseliny sialovej viazaných na α2,8 a dynamicky regulovaná posttranslačná modifikácia adhéznej molekuly neurálnych buniek (NCAM). Nedávne štúdie preukázali, že polysialylovaný NCAM (polySia-NCAM) podporuje regeneráciu v motorickom systéme. PSA vykazuje stabilitu v podmienkach bunkových kultúr a umožňuje indukovanú degradáciu enzýmami. Nedávno sa tiež zistilo, že PSA sa podieľa na riadiacich procesoch, ako je neuritogenéza, hľadanie axónových dráh a migrácia neuroblastov. U zvierat s geneticky vyradeným PSA sa prejavuje letálny fenotyp, ktorý má neúspešné hľadanie ciest; nervy spájajúce obe mozgové hemisféry boli aberantné alebo chýbali. PSA je teda nevyhnutný pre správny vývoj nervového systému.
Kolagén je hlavnou zložkou extracelulárnej matrice a široko sa využíva pri regenerácii a oprave nervov. Kolagénové gély sú vďaka svojej hladkej mikrogeometrii a priepustnosti schopné umožniť difúziu molekúl. Rýchlosť resorpcie kolagénu je možné kontrolovať zosieťovaním kolagénu polypoxidovými zlúčeninami. Okrem toho kolagénové lešenia typu I/III preukázali dobrú biokompatibilitu a sú schopné podporovať proliferáciu Schwannových buniek. Kolagénové konduity naplnené Schwannovými bunkami použité na preklenutie nervových medzier u potkanov však preukázali prekvapivo neúspešnú regeneráciu nervov v porovnaní s nervovými autotransplantátmi. Je to preto, že biokompatibilita nie je jediným faktorom potrebným na úspešnú regeneráciu nervu; v budúcich štúdiách bude potrebné preskúmať ďalšie parametre, ako je vnútorný priemer, vnútorná mikrotopografia, pórovitosť, hrúbka steny a hustota výsevu Schwannových buniek, aby sa zlepšili výsledky dosiahnuté týmito kolagénovými gélmi I/III.
Je dokázané, že vlákna pavúčieho hodvábu podporujú priľnavosť, proliferáciu a vitalitu buniek. Allmeling, Jokuszies a kol. dokázali, že Schwannove bunky sa rýchlo a pevne prichytia na hodvábne vlákna a rastú v bipolárnom tvare; miera proliferácie a prežívania bola na hodvábnych vláknach normálna.
Na vytvorenie nervového kanála so Schwannovými bunkami a acelularizovanými xenogénnymi žilami použili vlákna pavúčieho hodvábu. Schwannove bunky vytvorili pozdĺž hodvábnych vlákien v krátkom čase stĺpce, ktoré sa podobali Bungnerovým pásom, ktoré rastú in vivo po poranení PNS. Pavúčie hodváb sa doteraz v tkanivovom inžinierstve nepoužíval kvôli dravej povahe pavúkov a nízkej výťažnosti hodvábu z jednotlivých pavúkov. Zistilo sa, že druh Nephila clavipes produkuje hodváb, ktorý je menej imunogénny ako hodváb priadky morušovej; má pevnosť v ťahu 4 x 109 N/m, čo je šesťnásobok pevnosti ocele pri pretrhnutí. Keďže pavúčie hodváb je proteolyticky degradovaný, počas degradácie nedochádza k zmene pH oproti fyziologickému pH. Medzi ďalšie výhody pavúčieho hodvábu patrí jeho odolnosť voči hubovému a bakteriálnemu rozkladu počas niekoľkých týždňov a skutočnosť, že nenapučiava. Štruktúra hodvábu tiež podporuje priľnavosť a migráciu buniek. Zber hodvábu je však stále zdĺhavá úloha a presné zloženie sa líši medzi jednotlivými druhmi a dokonca aj medzi jedincami toho istého druhu v závislosti od stravy a prostredia. Existujú pokusy o syntetickú výrobu pavúčieho hodvábu. Sú potrebné ďalšie štúdie na overenie možnosti použitia pavúčieho hodvábu ako nervového vodiča in vitro a in vivo.
Chitosan a chitín patria do skupiny biopolymérov zložených z β(1-4)-viazaných podjednotiek N-acetyl-D-glukozamínu a D-glukozamínu. Chitosan vzniká alkalickou N-deacetyláciou chitínu, ktorý je po celulóze druhým najrozšírenejším prírodným polymérom. Chitosan je biologicky odbúrateľný polysacharid, ktorý je užitočný v mnohých biomedicínskych aplikáciách, napríklad ako chelatačné činidlo, nosič liečiv, membrána a prísada na úpravu vody. Chitosan je rozpustný v zriedených vodných roztokoch, ale pri neutrálnom pH sa vyzráža na gél. Nepodporuje dobre prichytenie a proliferáciu nervových buniek, ale môže byť posilnený prichytením peptidov odvodených od ECM. Chitosan obsahuje aj slabé mechanické vlastnosti, ktoré je náročnejšie prekonať.
Stupeň acetylácie (DA) rozpustného chitosanu sa pohybuje od 0 % do 60 % v závislosti od podmienok spracovania. Vykonala sa štúdia s cieľom charakterizovať, ako rôzne DA ovplyvňujú vlastnosti chitosanu. Rôzny DA sa získal použitím anhydridu kyseliny octovej alebo alkalickej hydrolýzy. Zistilo sa, že znižovanie acetylácie spôsobilo zvýšenie pevnosti v tlaku. Biodegradácia sa skúmala pomocou lyzozýmu, o ktorom je známe, že je zodpovedný za degradáciu chitosanu in vivo najmä hydrolyzáciou jeho glykozidových väzieb a je uvoľňovaný fagocytujúcimi bunkami po poškodení nervov. Z výsledkov vyplýva, že v prípade stredne vysokých DA došlo k zrýchleniu úbytku hmotnosti v porovnaní s vysokými a nízkymi DA počas skúmaného obdobia. Keď sa DRG bunky pestovali na N-acetylovanom chitosane, životaschopnosť buniek klesala so zvyšujúcim sa DA. Chitosan má tiež rastúcu hustotu náboja s klesajúcim DA, čo je zodpovedné za väčšiu adhéziu buniek. Kontrola DA chitosanu je teda dôležitá pre reguláciu času degradácie. Tieto poznatky by mohli pomôcť pri vývoji nervového vodiča z chitosanu.
Nedávno sa ukázalo, že aragonitové lešenia podporujú rast neurónov z hipokampov potkanov. Shany et al. (2006) dokázali, že aragonitové matrice môžu podporovať rast astrocytárnych sietí in vitro a in vivo. Aragonitové lešenia tak môžu byť užitočné na obnovu a regeneráciu nervového tkaniva. Predpokladá sa, že Ca2+ pochádzajúci z aragonitu je nevyhnutný na podporu adherencie buniek a kontaktu buniek s bunkami. Pravdepodobne sa to uskutočňuje pomocou adhéznych molekúl závislých od Ca2+, ako sú kadheríny. Aragonitové kryštalické matrice majú oproti hydrogélom mnoho výhod. Majú väčšie póry, čo umožňuje lepší rast buniek, a materiál je bioaktívny v dôsledku uvoľňovania Ca2+, čo podporuje adhéziu a prežívanie buniek. Okrem toho majú aragonitové matrice vyššiu mechanickú pevnosť ako hydrogély, čo im umožňuje odolať väčšiemu tlaku pri vtlačení do poraneného tkaniva.
Alginát je polysacharid, ktorý ľahko vytvára reťazce; môže byť zosieťovaný na svojich karboxylových skupinách s viacvalentnými katiónmi, ako sú Cu2+, Ca2+ alebo Al3+, aby sa vytvoril mechanicky stabilnejší hydrogél. Algináty vápnika tvoria polyméry, ktoré sú biokompatibilné a neimunogénne a používajú sa v aplikáciách tkanivového inžinierstva. Nie sú však schopné podporovať pozdĺžne orientovaný rast, ktorý je potrebný na opätovné spojenie proximálneho konca s jeho cieľom. Na prekonanie tohto problému boli vyvinuté anizotropné kapilárne hydrogély (ACH). Vytvárajú sa vrstvením vodných roztokov alginátu sodného s vodnými roztokmi viacvalentných katiónov. Po vytvorení ióny elektrolytu difundujú do vrstiev polymérneho roztoku a disipatívny konvekčný proces spôsobuje zrážanie iónov, čím sa vytvárajú kapiláry. Výsledkom disipatívneho konvekčného procesu je odpor difúznych gradientov a trenia medzi polyelektrolytovými reťazcami. Steny kapiláry sú vystlané vyzrážaným kovovým alginátom, zatiaľ čo lúmen je vyplnený vytlačenou vodou.
Prang et al. (2006) hodnotili schopnosť ACH gélov podporovať cielený axonálny rast v poškodenom CNS cicavcov. Multivalentné ióny použité na vytvorenie ACH gélov na báze alginátu boli ióny medi, ktorých difúzia do vrstiev alginátu sodného vytvorila hexagonálne štruktúrované anizotropné kapilárne gély. Po vyzrážaní celý gél prechádzal pozdĺžne orientovanými kapilárami. ACH lešenia podporovali prežívanie dospelých NPC a regeneráciu vysoko orientovaných axónov. Ide o prvý prípad použitia alginátov na výrobu anizotropne štruktúrovaných kapilárnych gélov. V budúcich štúdiách je potrebné preskúmať dlhodobú fyzikálnu stabilitu ACH lešení, pretože regenerácia axónov CNS môže trvať mnoho mesiacov; okrem schopnosti poskytovať dlhodobú podporu však musia byť lešenia aj degradovateľné. Zo všetkých biologických a syntetických biopolymérov, ktoré skúmali Prang et al. (2006), sa len gély na báze agarózy mohli porovnávať s lineárnou regeneráciou spôsobenou lešeniami ACH. V budúcich štúdiách bude tiež potrebné preskúmať, či lešenia ACH umožňujú reinerváciu cieľa in vivo po poranení miechy.
Kyselina hyalurónová (HA) je široko používaný biomateriál vďaka svojej vynikajúcej biokompatibilite a rôznorodosti fyziologických funkcií. Hojne sa vyskytuje v extracelulárnej matrici (ECM), kde prostredníctvom špecifických interakcií HA s proteínmi viaže veľké glykozaminoglykány (GAG) a proteoglykány. HA tiež viaže receptory na povrchu buniek, ako je CD44, čo vedie k aktivácii vnútrobunkových signálnych kaskád, ktoré regulujú adhéziu a pohyblivosť buniek a podporujú proliferáciu a diferenciáciu. O HA je tiež známe, že podporuje angiogenézu, pretože jeho degradačné produkty stimulujú proliferáciu a migráciu endotelových buniek. HA teda zohráva kľúčovú úlohu pri udržiavaní normálnych procesov potrebných na prežitie tkaniva. Nemodifikovaná HA sa používa v klinických aplikáciách, ako je očná chirurgia, hojenie rán a plastická chirurgia. HA sa môže zosieťovať a vytvoriť hydrogély. Hydrogély HA, ktoré boli buď nemodifikované, alebo modifikované laminínom, boli implantované do lézie centrálneho nervového systému dospelého človeka a testované na ich schopnosť indukovať tvorbu nervového tkaniva v štúdii Houa a kol. Preukázali schopnosť podporovať rast buniek a angiogenézu, okrem toho inhibovali tvorbu gliových jaziev. Hydrogély HA modifikované laminínom boli tiež schopné podporovať predlžovanie neuritov. Tieto výsledky podporujú HA gély ako sľubný biomateriál na vedenie nervov.
Okrem materiálu lešenia a fyzikálnych podnetov možno do bioumelého nervového kanála začleniť aj biologické podnety vo forme buniek. V nervovom systéme existuje mnoho rôznych typov buniek, ktoré pomáhajú podporovať rast a udržiavanie neurónov. Tieto bunky sa súhrnne označujú ako gliové bunky. Gliové bunky sa skúmali v snahe pochopiť mechanizmy, ktoré stoja za ich schopnosťou podporovať regeneráciu axónov. Rozoberajú sa tri typy gliových buniek: Schwannove bunky, astrocyty a bunky čuchového obalu. Okrem gliových buniek majú potenciálny prínos pre opravu a regeneráciu aj kmeňové bunky, pretože mnohé z nich sú schopné diferencovať sa na neuróny alebo gliové bunky. V tomto článku sa stručne rozoberá použitie dospelých, transdiferencovaných mezenchýmových, ektomesenchýmových, neurálnych a neurálnych progenitorových kmeňových buniek.
Gliové bunky sú nevyhnutné na podporu rastu a udržiavanie neurónov v periférnom a centrálnom nervovom systéme. Väčšina gliových buniek je špecifická pre periférny alebo centrálny nervový systém. Schwannove bunky sa nachádzajú v periférnom nervovom systéme, kde myelinizujú axóny neurónov. Astrocyty sú špecifické pre centrálny nervový systém; poskytujú živiny, fyzickú podporu a izoláciu neurónom. Tvoria tiež hematoencefalickú bariéru. Bunky čuchového obalu však prekračujú hranicu CNS a CNS, pretože vedú neuróny čuchových receptorov z PNS do CNS.
Schwannove bunky (SC) sú kľúčové pre regeneráciu periférnych nervov; zohrávajú štrukturálnu aj funkčnú úlohu. Schwannove bunky sú zodpovedné za účasť na Wallerovej degenerácii aj na Bungnerových pásmach. Keď je periférny nerv poškodený, Schwannove bunky menia svoju morfológiu, správanie a proliferáciu, aby sa zapojili do Wallerovej degenerácie a Bungnerových pásov. Pri Wallerovej degenerácii Schwannove bunky rastú v usporiadaných stĺpcoch pozdĺž endoneurálnej trubice a vytvárajú Bungnerov pás (boB), ktorý chráni a zachováva endoneurálny kanál. Okrem toho uvoľňujú neurotrofické faktory, ktoré v spojení s makrofágmi zlepšujú opätovný rast. Použitie Schwannových buniek v nervovom tkanivovom inžinierstve má aj určité nevýhody; napríklad je ťažké selektívne izolovať Schwannove bunky a po izolácii vykazujú slabú proliferáciu. Jedným zo spôsobov, ako prekonať túto ťažkosť, je umelo indukovať iné bunky, napríklad kmeňové bunky, na fenotypy podobné SC.
Eguchi et al. (2003) skúmali použitie magnetických polí na vyrovnanie Schwannových buniek. Použili supravodivý magnet horizontálneho typu, ktorý vo svojom strede vytvára pole 8 T. Počas 60 hodín od vystavenia sa Schwannove bunky zoradili rovnobežne s poľom; počas rovnakého intervalu sa Schwannove bunky, ktoré neboli vystavené, orientovali náhodne. Predpokladá sa, že rozdiely v citlivosti membránových zložiek a cytoskeletálnych prvkov na magnetické pole môžu spôsobiť magnetickú orientáciu. Kolagénové vlákna boli tiež vystavené magnetickému poľu a v priebehu 2 hodín sa zarovnali kolmo na magnetické pole, zatiaľ čo kolagénové vlákna bez vystavenia magnetickému poľu vytvorili náhodný sieťový vzor. Pri kultivácii na kolagénových vláknach sa Schwannove bunky po dvoch hodinách pôsobenia 8-T magnetického poľa zarovnali pozdĺž magneticky orientovaného kolagénu. Naopak, Schwannove bunky sa náhodne orientovali na kolagénových vláknach bez vystavenia magnetickému poľu. Kultivácia na kolagénových vláknach teda umožnila, aby sa Schwannove bunky orientovali kolmo na magnetické pole a orientovali sa oveľa rýchlejšie.
Tieto zistenia môžu byť užitočné pri vyrovnávaní Schwannových buniek pri poškodení nervového systému, aby sa podporila tvorba Bungnerových pásov, ktoré sú rozhodujúce pre udržanie endoneurálnej trubice, ktorá vedie odrastajúce axóny späť k ich cieľom. Je takmer nemožné vyrovnať Schwannove bunky vonkajšími fyzikálnymi technikami, preto je objav alternatívnej techniky na vyrovnanie významný. Vyvinutá technika má však stále svoje nevýhody, a to, že na udržanie magnetického poľa počas dlhšieho obdobia je potrebné značné množstvo energie.
Vykonali sa štúdie zamerané na zvýšenie migračnej schopnosti Schwannových buniek. Migráciu Schwannových buniek regulujú integríny s molekulami ECM, ako sú fibronektín a laminín. Okrem toho je známe, že adhézna molekula neurálnych buniek (NCAM) zvyšuje pohyblivosť Schwannových buniek in vitro. NCAM je glykoproteín, ktorý je exprimovaný na membránach axónových a Schwannových buniek. Kyselina polysialová (PSA) sa syntetizuje na NCAM pomocou polysalyltransferázy (PST) a sialyltransferázy X (STX). Počas vývoja CNS je expresia PSA na NCAM regulovaná až do postnatálnych štádií. V dospelom mozgu sa však PSA nachádza len v oblastiach s vysokou plasticitou
. Expresia PSA sa nevyskytuje na Schwannových bunkách.
Lavdas et al. (2006) skúmali, či trvalá expresia PSA na Schwannových bunkách zvyšuje ich migráciu. Schwannove bunky boli trandukované retrovírusovým vektorom kódujúcim STX s cieľom indukovať expresiu PSA. Schwannove bunky exprimujúce PSA dosiahli zvýšenú pohyblivosť, ako sa ukázalo v teste premostenia medzier a po transplantácii v kultúrach postnatálnych plátkov predného mozgu. Expresia PSA nezmenila molekulárnu a morfologickú diferenciáciu. Schwannove bunky exprimujúce PSA boli schopné myelinizovať axóny CNS v mozočkových rezoch, čo za normálnych okolností nie je možné in vivo. Je nádej, že tieto Schwannove bunky exprimujúce PSA budú schopné migrovať po celom CNS bez straty myelinizačných schopností a môžu sa stať užitočnými na regeneráciu a myelinizáciu axónov v centrálnom nervovom systéme.
Astrocyty sú gliové bunky, ktoré sa hojne vyskytujú v centrálnom nervovom systéme. Sú kľúčové pre metabolickú a trofickú podporu neurónov; okrem toho astrocyty zabezpečujú iónovú pufráciu a klírens neurotransmiterov. Rastúce axóny sa riadia pokynmi vytvorenými astrocytmi; astrocyty tak môžu regulovať určovanie dráhy neurónov a následne aj modelovanie vo vyvíjajúcom sa mozgu. Gliová jazva, ktorá sa vytvára po poranení v centrálnom nervovom systéme, je tvorená astrocytmi a fibroblastmi; je najvýznamnejšou prekážkou regenerácie. Gliová jazva pozostáva z hypertrofovaných astrocytov, spojivového tkaniva a ECM. Dva ciele nervového tkanivového inžinierstva sú pochopiť funkciu astrocytov a vyvinúť kontrolu nad rastom astrocytov. Štúdie Shanyho a i. (2006) preukázali, že miera prežitia astrocytov sa zvyšuje na 3D aragonitových matriciach v porovnaní s konvenčnými 2D bunkovými kultúrami. Schopnosť bunkových procesov rozťahovať sa cez krivky a póry umožňuje tvorbu viacerých bunkových vrstiev s komplexnou 3D konfiguráciou.
Tri rôzne spôsoby, ktorými bunky získali 3D tvar, sú:
V bežnej bunkovej kultúre je rast obmedzený na jednu rovinu, čo spôsobuje tvorbu monovrstvy s väčšinou buniek, ktoré sa dotýkajú povrchu; 3D zakrivenie aragonitového povrchu však umožňuje vznik viacerých vrstiev a vzájomný kontakt astrocytov, ktoré sú od seba vzdialené. Je dôležité podporiť tvorbu procesov podobnú 3D podmienkam in vivo, pretože morfológia astrocytárnych procesov je nevyhnutná pri usmerňovaní smeru regenerujúcich axónov. Topografia aragonitu poskytuje vysoký pomer povrchu k objemu a chýbajú v nej okraje, čo vedie k zníženiu efektu okrajov kultúry. Kryštalické matrice, ako je tu uvedený aragonit, umožňujú podporiť komplexnú tvorbu 3D tkaniva, ktoré sa približuje podmienkam in vivo.
Bunky čuchového obalu
Primárny čuchový systém cicavcov si zachoval schopnosť nepretržitej regenerácie počas dospelosti. Neuróny čuchových receptorov majú priemernú životnosť 6 – 8 týždňov, a preto musia byť nahradené bunkami diferencovanými z kmeňových buniek, ktoré sa nachádzajú vo vrstve na báze blízkeho epitelu. Nové neuróny čuchových receptorov musia vysielať svoje axóny cez CNS do čuchového bulbu, aby boli funkčné. Rast axónov sa riadi zložením glií a cytoarchitektúrou čuchového bulbu okrem prítomnosti buniek čuchového obalu (OEC).
Predpokladá sa, že OEC vznikajú v čuchovom plaku, čo naznačuje iný vývojový pôvod ako u iných podobných mikroglií nervového systému.
Ďalším zaujímavým konceptom je, že OEC sa nachádzajú v periférnej aj centrálnej nervovej sústave primárneho čuchového systému, teda v čuchovom epiteli a bulbe.
OEC sú podobné Schwannovým bunkám v tom, že po poranení poskytujú upreguláciu nízkoafinitného NGF receptora p75; na rozdiel od Schwannových buniek však produkujú nižšie hladiny neurotrofínov. Viaceré štúdie preukázali, že OEC sú schopné podporovať regeneráciu poškodených axónov, ale tieto výsledky sa často nedajú reprodukovať.
Napriek tomu sa OEC dôkladne skúmali v súvislosti s poraneniami miechy, amyotrofickou laterálnou sklerózou a inými neurodegeneratívnymi ochoreniami. Výskumníci predpokladajú, že tieto bunky majú jedinečnú schopnosť remyelinizovať poškodené neuróny.
OEC majú podobné vlastnosti ako astrocyty, ktoré sú náchylné na vírusovú infekciu.
Kmeňové bunky sa vyznačujú schopnosťou dlhodobo sa samoobnovovať a stále si zachovávať schopnosť diferencovať sa v jednej alebo viacerých bunkových líniách. Kmeňové bunky môžu byť unipotentné, multipotentné alebo pluripotentné, čo znamená, že sa môžu diferencovať na jeden, viacero alebo všetky typy buniek. Pluripotentné kmeňové bunky sa môžu stať bunkami odvodenými z ktorejkoľvek z troch zárodočných vrstiev embrya. Kmeňové bunky majú výhodu oproti gliovým bunkám, pretože sa dokážu ľahšie množiť v kultúre. Stále je však ťažké prednostne diferencovať tieto bunky na rôzne typy buniek usporiadaným spôsobom. Ďalšou ťažkosťou v prípade kmeňových buniek je, že chýba presne definovaná definícia kmeňových buniek okrem krvotvorných kmeňových buniek (HSC). Každý „typ“ kmeňových buniek má viac ako jednu metódu na identifikáciu, izoláciu a expanziu buniek; to spôsobilo veľa nejasností, pretože všetky kmeňové bunky „typu“ (neurálne, mezenchýmové, retinálne) sa nemusia za rovnakých podmienok správať rovnako.
Dospelé kmeňové bunky nie sú schopné sa množiť a diferencovať tak účinne in vitro ako in vivo. Dospelé kmeňové bunky môžu pochádzať z mnohých rôznych tkanivových lokalít, ale je ťažké ich izolovať, pretože sú definované správaním a nie povrchovými markermi. Zatiaľ nebola vyvinutá metóda na jasné rozlíšenie kmeňových buniek od diferencovaných buniek, ktoré ich obklopujú. Povrchové markery sa však stále dajú do určitej miery použiť na odstránenie väčšiny nežiaducich diferencovaných buniek. Plasticita kmeňových buniek je schopnosť diferencovať sa cez hranice embryonálnych zárodočných línií. Hoci o prítomnosti plasticity sa vedú ostré spory. Niektorí tvrdia, že plasticita je spôsobená heterogenitou medzi bunkami alebo fúziami buniek. V súčasnosti je možné diferencovať bunky naprieč bunkovými líniami s výťažnosťou od 10 % do 90 % v závislosti od použitých techník. Je potrebné vykonať ďalšie štúdie, aby sa štandardizovala výťažnosť transdiferenciácie. Transdiferenciácia multipotentných kmeňových buniek je potenciálnym prostriedkom na získanie kmeňových buniek, ktoré nie sú k dispozícii alebo sa nedajú ľahko získať u dospelých.
Mezenchýmové kmeňové bunky sú dospelé kmeňové bunky, ktoré sa nachádzajú v kostnej dreni; sú schopné diferencovať sa do línií mezodermálneho pôvodu. Príkladmi tkanív, ktoré tvoria, sú kosti, chrupavky, tuk a šľachy. MSC sa získavajú aspiráciou kostnej drene. Rast MSC podporuje mnoho faktorov vrátane: rastového faktora odvodeného od krvných doštičiek, epidermálneho rastového faktora β a inzulínu podobného rastového faktora-1. Okrem bežných diferenciačných ciest sa MSC môžu transdiferencovať do nemezenchýmových línií, ako sú astrocyty, neuróny a myelinizačné bunky PNS. MSC sú potenciálne užitočné pre stratégie regenerácie nervov, pretože:
Keilhoff et al. (2006) vykonali štúdiu, v ktorej porovnávali schopnosť regenerácie nervov nediferencovaných a transdiferencovaných MSC so Schwannovými bunkami v devitalizovaných svalových štepoch preklenujúcich 2 cm medzeru v sedacom nerve potkana. Všetky bunky boli autológne. Transdiferencované MSC boli kultivované v zmesi faktorov s cieľom podporiť tvorbu buniek podobných Schwannovým bunkám. Nediferencované MSC nevykazovali žiadnu regeneračnú schopnosť, zatiaľ čo transdiferencované MSC vykazovali určitú regeneračnú schopnosť, hoci nedosahovala schopnosť Schwannových buniek.
Ektomesenchymálne kmeňové bunky (EMSC)
Neurálne kmeňové bunky (NSC) majú schopnosť samoobnovy a diferenciácie do neuronálnych a gliových línií. Na usmernenie diferenciácie NSC bolo vyvinutých mnoho kultivačných metód, avšak vytvorenie biomateriálov na usmernenie diferenciácie NSC sa považuje za klinicky relevantnejšiu a použiteľnejšiu technológiu.[potrebná citácia] Jedným z prístupov na vytvorenie biomateriálu na usmernenie diferenciácie NSC je kombinácia zložiek extracelulárnej matrice (ECM) a rastových faktorov. Veľmi nedávna štúdia Nakajima, Ishimuro a kol. skúmala účinky rôznych molekulárnych dvojíc pozostávajúcich z rastového faktora a zložky ECM na diferenciáciu NSC na astrocyty a neurónové bunky. Skúmanými zložkami ECM boli laminín-1 a fibronektín, ktoré sú prirodzenými zložkami ECM, a Pronektín F plus (Pro-F) a Pronektín L (Pro-L), ktoré sú umelými zložkami ECM, a poly(etylénoimín) (PEI). Použité neurotrofické faktory boli epidermálny rastový faktor (EGF), fibroblastový rastový faktor-2 (FGF-2), nervový rastový faktor (NGF), neurotrofín-3 (NT-3) a ciliárny neurotrofický faktor (CNTF). Párové kombinácie boli imobilizované na matricové bunkové matrice, na ktorých boli kultivované NSC. Po 2 dňoch kultivácie sa bunky farbili protilátkami proti nestínu, β-tubulínu III a GFAP, ktoré sú markermi NSC, neurónových buniek a astrocytov. Výsledky poskytujú cenné informácie o výhodných kombináciách zložiek ECM a rastových faktorov ako praktickej metódy na vývoj biomateriálu na usmernenie diferenciácie NSC.
V súčasnosti sa intenzívne skúmajú neurotrofické faktory na použitie v bioumelých nervových kanáloch, pretože sú potrebné in vivo na riadenie rastu a regenerácie axónov. V štúdiách sa neurotrofické faktory zvyčajne používajú v spojení s inými technikami, ako sú biologické a fyzikálne podnety vytvorené pridaním buniek a špecifických topografií. Neurotrofické faktory môžu alebo nemusia byť imobilizované na štruktúru lešenia, hoci sa uprednostňuje imobilizácia, pretože umožňuje vytvárať trvalé, kontrolovateľné gradienty. V niektorých prípadoch, ako sú systémy na dodávanie nervových liečiv, sú voľne imobilizované tak, aby sa mohli selektívne uvoľňovať v určenom čase a v určenom množstve. Dodávanie liečiv je ďalším krokom nad rámec základného pridávania rastových faktorov do nervových vodičov.
Mnohé biomateriály používané na vedenie nervov sú biomimetické materiály. Biomimetické materiály sú materiály, ktoré boli navrhnuté tak, aby vyvolávali špecifické bunkové reakcie sprostredkované interakciami s peptidmi naviazanými na skelet z proteínov ECM; v podstate ide o začlenenie peptidov viažucich bunky do biomateriálov prostredníctvom chemickej alebo fyzikálnej modifikácie.
Synergizmus sa často vyskytuje pri kombinácii dvoch prvkov; je to interakcia medzi dvoma prvkami, ktorá spôsobuje účinok väčší ako kombinované účinky každého prvku samostatne. Synergizmus sa prejavuje pri kombinácii materiálu lešenia a topografie s bunkovou terapiou, neurotrofickými faktormi a biomimetickými materiálmi. Skúmanie synergizmu je ďalším krokom po tom, čo sa jednotlivé techniky samy o sebe osvedčili. Kombinácie týchto rôznych faktorov je potrebné dôkladne preskúmať, aby sa optimalizovali synergické účinky.
Optimalizácia kombinácií neurotrofických faktorov
Predpokladalo sa, že interakcie medzi neurotrofickými faktormi by mohli zmeniť optimálne koncentrácie jednotlivých faktorov. Hoci prežitie buniek a udržanie fenotypu sú dôležité, dôraz pri hodnotení sa kládol na predlžovanie neuritov. Kombinácia NGF, neurotrofického faktora odvodeného od gliových buniek (GDNF) a ciliárneho neurotrofického faktora (CNTF) bola predložená kultúram dorzálnych koreňových ganglií in vitro. Z každej neurotrofickej skupiny sa použil jeden faktor. Zistilo sa, že nie je rozdiel v individuálnej optimálnej koncentrácii a kombinovanej optimálnej koncentrácii; okolo 5. alebo 6. dňa sa však neurity prestali predlžovať a začali degradovať. Predpokladalo sa, že to bolo spôsobené nedostatkom kritickej živiny alebo správnych gradientov; predchádzajúce štúdie ukázali, že rastové faktory dokážu optimalizovať predlžovanie neuritov najlepšie, keď sú prezentované v gradientoch. Budúce štúdie o kombináciách neurotrofických faktorov budú musieť zahŕňať gradienty.
Kombinácia adhezívnych molekúl neurónových buniek a GFD-5
Molekuly bunkovej adhézie (CAM) a neurotrofické faktory zabudované do biokompatibilných matríc sú relatívne novým konceptom, ktorý sa skúma. CAM z imunoglobulínovej superrodiny (IgSF), ktorá zahŕňa L1/NgCAM a neurofascín, sú obzvlášť sľubné, pretože sú exprimované vo vyvíjajúcom sa nervovom systéme na neurónoch alebo Schwannových bunkách. Je o nich známe, že slúžia ako vodiace signály a sprostredkúvajú diferenciáciu neurónov. Neurotrofické faktory, ako napríklad NGF a rastový diferenciačný faktor 5 (GDF-5), sú však dobre známe ako promótory regenerácie in vivo. Nedávna štúdia Niereho, Browna a kol. skúmala synergické účinky kombinácie L1 a neurofascínu s NGF a GDF-5 na neuróny DRG v kultúre; táto kombinácia zvýšila rast neuritov. Ďalšie zlepšenie sa preukázalo kombináciou L1 a neurofascínu do umelého fúzneho proteínu, ktorý zvyšuje účinnosť, keďže faktory sa nedodávajú jednotlivo. Nielenže sa môžu použiť rôzne podnety, ale môžu sa dokonca zlúčiť do jedného „nového“ podnetu.
Topografia v súčinnosti s chemickými a biologickými signálmi
Účinok viacerých typov podnetov, ako sú chemické, fyzikálne a biologické podnety, na diferenciáciu neurónových progenitorových buniek nebol doteraz preskúmaný. Uskutočnila sa štúdia, v ktorej boli dospelým potkaních hipokampálnym progenitorovým bunkám (AHPC) predložené tri rôzne podnety: postnatálne potkaních astrocytov typu 1 (biologický), laminín (chemický) a substrát s mikrotlačou (fyzikálny). Viac ako 75 % AHPC sa zarovnalo do 20° drážok v porovnaní s náhodným rastom na nevzorovaných substrátoch. Keď sa AHPC pestovali na substrátoch s mikropatternami s astrocytmi, rast bol ovplyvnený astrocytmi, ktoré sa zarovnali s drážkami; konkrétne AHPC predĺžili procesy pozdĺž astrocytových cytoskeletálnych vlákien. Zosúladenie však nebolo také výrazné ako v prípade AHPC v samotnej kultúre s mikroskopickým substrátom. Na posúdenie rôznych fenotypov vyjadrených v dôsledku diferenciácie sa bunky farbili protilátkami proti β-tubulínu triedy III (TuJI), proteínu interagujúcemu s receptormi (RIP) a gliálnemu fibrilárnemu acidobázickému proteínu (GFAP), ktoré sú markermi pre skoré neuróny, oligodendrocyty, resp. astrocyty. Najväčšia diferenciácia bola pozorovaná pri AHPC kultivovaných na vzorovaných substrátoch s astrocytmi.